Флуоресцентный счётчик соматических клеток «Эксперт ССК»

• для приёмки молока в лабораториях, как самый точный метод подсчёта соматических клеток в соответствии с ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010 и ГОСТ 23453-2014 Молоко сырое. Методы определения соматических клеток (с Поправкой) 01.01.2016 г.
• для выявления мастита на ранних стадиях у поголовья во избежание излишнего медикаментозного лечения клинических и микозных (дрожжевой мастит) форм мастита
• для ветеринарного надзора в управлениях ветеринарии и СББЖ
• для обучающего процесса студентов, для научной работы

Счётчик соматических клеток «Эксперт ССК» построен на основе метода флуоресцентной микроскопии и сочетает в себе: автоматический микроскоп, чувствительную камеру, встроенный компьютер и программное обеспечение.

Алгоритм анализа цифрового изображения позволяет сосчитать количество соматических клеток, рассчитать их концентрацию, исходя из размера и типа.

Неважно, какая стоит перед Вами задача: только определить количество соматических клеток для приёмки молока, или же разобраться с типом мастита и теми возбудителями, которые попали в организм животного и далее подобрать соответствующее лечение – «Эксперт ССК» даёт Вам широкие возможности:

Данный алгоритм позволяет многое:

• Полный визуальный контроль работы автоматического микроскопа по полученным снимкам на экране анализатора.
• Сосчитать количество соматических клеток и дифференцировать их:
• по размеру*;
• по типу, что в свою очередь позволяет отделять субклинический (клинический) мастит от микозного (дрожжевого) и в последствии избавить животное от излишнего медикаментозного лечения антибиотиками.

Такой подход положительно скажется на сортности молока, а значит и его цене (в нём будет меньше антибиотиков, или не будет вовсе).

* - дифференциация клеток по размеру является одним из важных факторов. Так для маститных клеток, вызванных клинической стадией мастита определён размер от 4 до 20 мКм; для бактерий от 0 до 6 мКм; для лимфоцитов (от 5 до 10 мКм).

Однако, согласно ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010 и ГОСТ 23453-2014 Молоко сырое. Методы определения соматических клеток (с Поправкой) 01.01.2016 г., как «соматические», к подсчёту принимаются клетки от 8 до 20 мКм. Именно на этот диапазон настроен наш анализатор.

Таким образом устанавливая размер, мы можем считать только те клетки, которые нас интересуют. А анализатор увидит все – от самых мелких до самых крупных.

Реальное изображение результата анализа.

Отмечены все подсчитанные клетки. Соматические клетки помечены красными квадратами, дрожжевые клетки - синими квадратами.

Программа показывает отредактированное изображение, на котором только соматические клетки.

Флажки показывают следующие состояния здоровья животного:

•  - Субклинический мастит
•  - Клинический мастит
•  - Наличие дрожжевых клеток в пробе молока. Возможен дрожжевой мастит. Необходимо выполнить тест на дрожжевой мастит.

3. Настраивать программное обеспечение на выявление сортового/не сортового молока. Границы Вы устанавливаете сами.

Если анализатор используется на приёмке молока: установите опасную величину чуть Выше нормы для молока высшего сорта (в диапазоне от 300 до 500 тысяч колоний клеток), а критическую величину для «несортового» молока (500 или 700 тысяч).

Если анализатор используется для диагностики стада: установите «опасную» величину для показателей субклинического мастита, а «критическую» – для клинического. Конкретные цифры можно брать из технического регламента на молоко и ГОСТы. Либо обратитесь за консультацией к нам!

4. Видеть средний размер клеток, которые преобладают в анализируемой пробе. Это позволит сделать точный вывод о диагнозе. На левой части рисунка графически изображено соотношение количества клеток в одной пробе по их размеру. Основная концентрация клеток в диапазоне от 6 до 14 мкм, что соответствует нейтрофилам, макрофагам, лимфоцитам, лейкоцитам и клеткам эпителия – на лицо клинический мастит! В верхней левой части мы видим подменю, в котором устанавливается диапазон для подсчёта клеток. На данном примере он установлен, как 8-20 мКм, что соответствует ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010 и ГОСТ 23453-2014 Молоко сырое. Методы определения соматических клеток (с Поправкой) 01.01.2016 г. В данной пробе молока в этом диапазоне общее количество соматических клеток составляет 893*10(3) или 893 тысячи колоний клеток, что отображено в верхнем правом углу рисунка. Однако, график на правой стороне рисунка даёт нам понять, что в процессе измерения мы видим абсолютно всё в диапазоне от 1 до 30 мКм (от бактерий до самых крупных дрожжей и сгустков).

5. Идентифицировать тип мастита по возбудителям: стрептококковый, стафилококковый, микозный (дрожжевой), мастит микоплазмы.

Для этого Вы сначала смотрите на реальное изображение (на данном рисунке они изображены зелёным цветом на чёрном фоне). Причём эти рисунки можно увеличить многократно, чтобы рассмотреть каждую клетку(группу).

После этого в меню можете выбрать пункт «отметить все клетки», либо «отметить только соматические», либо «отметить только дрожжевые».

И наконец, третий критерий – это соотношение количества клеток в зависимости от их размера на графиках. Тут же будет указание среднего размера клеток в данной пробе (тех, которых больше всего). Таким образом, если в исследуемой пробе молока преобладает микозный (дрожжевой) мастит: сначала мы это можем видеть на фото снимка (мастит Микоплазмы – клетки сгруппированы в «зелёные облака»), потом каждую клеточку синим квадратом отметит анализатор после выбора режима «отметить все клетки», либо «отметить только дрожжевые». После чего, посмотрев на график, мы убедимся, что средняя величина преобладающих клеток в данной пробе соответствует клеткам дрожжей (они самые крупные, размером от 10 до 30 мкм).

На этом рисунке наглядно видно, насколько можно увеличить фотографии клеток, чтобы идентифицировать их визуально.

Далее, идёт расшифровка результата: общее количество соматических клеток 574 тысячи колоний; стадия мастита клиническая (критическая, отмеченная красным флажком); среднее значение клеток, соответствующих типу установленного мастита, равно 9,72 мКм (зелёная тонкая черта на графике). Основная часть клеток находиться в диапазоне от 7 до 11 мКм.

Межгосударственный стандарт на молоко сырое. Методы определения соматических клеток.

Введён в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 января 2016 г.

Итак, согласно ГОСТ 23453-2014, в России и странах таможенного Союза для подсчёта соматических клеток применяется 4 метода. Дополним: 2 из них косвенные и 2 прямые(арбитражные).

Косвенные методы:

• а) Визуальный метод определения соматических клеток по изменению вязкости (с применением препарата «Мастоприм». Метод самый старый и наименее точный (если вообще понятие «точный» к нему применимо). Нижний предел точности – 500 тыс. колоний клеток. Дискретность, аналогичная – 500 тыс. Таким образом, с помощью этого метода мы лишь можем сказать: либо в пробе молока кол-во клеток в диапазоне от 500 до 1000 тыс., либо более 1000 тыс. клеток.
• б) Метод определения количества соматических клеток с применением вискозиметра. По сути, это тот же визуальный метод с применением «Мастоприма», который был автоматизирован: перемешивание пробы и подсчёт времени вытекания в авто режиме делает анализатор. Но минусы остались: ещё в 2011-2013 гг. исследования ВНИИ маслоделия и сыроделия (ГНУ «ВНИИМС РАН») в г. Углич показали, что при фальсификации молока перекисью водорода, мочевиной, содой, либо нагревание молока до температур пастеризации приводит к сбою показаний прибора и вискозиметр показывает менее 90 тыс. клеток независимо от их истинного содержания.

Прямые (арбитражные методы)

• а) Метод контроля соматических клеток флуоресцентной микроскопией с использованием анализатора «Эксперт ССК»
• б) Прямой метод определения соматических клеток путём микроскопирования.

Таким образом, если стоит задача наиболее точно определить количество соматических клеток, то остаётся два метода: "Микроскопический" - прямой подсчёт с использованием микроскопа и "Флуоресцентный" - по сути, тот же микроскопический метод, в котором применяется краситель и автоматический микроскоп, результаты которого обрабатывает встроенный компьютер по средствам программного обеспечения.

Прямой подсчёт с использованием микроскопа сопряжён с применением опасных материалов, требует специального оснащения оборудованием. Подготовка и профессиональные навыки микробиолога являются основными решающими факторами использования данного метода. Данный метод может быть реализован только в условиях специализированных лабораторий. Метод крайне трудоёмкий, а время проведения одного анализа составляет не менее 3-4 часов. Поэтому в ГОСТе 23453-2014(01.01.2016) для данного метода среднее квадратичное отклонение повторяемости допустимо на уровне 15% для концентрации на уровне 245 тыс. клеток в 1см кубическом. А предел повторяемости и вовсе – 43,6%. Следовательно, точность данного метода относительная – полностью зависит от лаборанта.

Однако, метод прямого микроскопирования является единственным методом контроля, позволяющим увидеть, идентифицировать и сосчитать соматические клетки в молоке. Нужно только его упростить для лаборанта, по возможности избавить от необходимости использования в процессе большого кол-ва лабораторной посуды, реактивов и прочего. По сути – автоматизировать процесс измерения и главное – подсчёта и свести возможную ошибку лаборанта к минимуму.

Всё это позволяет флуоресцентная микроскопия!

Снимок на экране «Эксперт ССК» – процесс подсчета и дифференциации клеток прошел в автоматическом режиме за 1 минуту. Оператору осталось только зафиксировать результат – никакой специальной квалификации для этого не требуется. Влияние ошибки оператора на результат сводится к нулю.

Так выглядит проба молока под увеличением микроскопа в чашке Петри, после смешивания с реактивами. Время проведения одного анализа 3-4 часа. Результат зависит от теоретических знаний и практических навыков микробиолога – велика вероятность ошибки, вызванной человеческим фактором.

На этом снимке присутствуют только соматические клетки: анализатор их “окрасил”, отделил все “лишнее” и дифференцировал по типу. Весь процесс занимает 1-2 минуты.

На этом снимке представлен вид пробы молока в чашке Петри через окуляр микроскопа. Далее, микробиологу предстоит отделить соматические клетки от шариков молочного жира, сгустков, слизи и всего “лишнего”. После чего, применить сложный алгоритм по подсчету только “нужных” клеток. Это очень сложный и продолжительный процесс.

• Коэффициент вариации (CV)% измеряется в эталонном режиме в соответсвии с инструкцией для эталонной процедуры тестирования.
• Определяется путем анализа стандартных эталонных образцов молока из сертифицированных молочных лабораторий.
• Стандартные эталонные образцы молока не включают большое количество клеточных фрагментов и не включают дрожжевые клетки.
• «Эксперт ССК» использует для анализа наибольший объем пробы молока (до 9 мкл), что гарантирует более низкий коэффициент вариации, чем прямой микроскопический подсчет.

Пионером в этом вопросе выступила Шведская компания «Делаваль». Их счётчик «Delaval DCC» автоматизировал этот процесс, а для измерения требовались одноразовые кассеты.

У «Шведов», идея в целом удалась. Но есть недостатки: погрешность измерения всё равно достигает 25%, стоимость одного измерения очень дорогое – одна кассета стоит в районе 150-180 рублей. А диапазон подсчёта по размеру клеток применяется под Европейские стандарты и разниться с нашим ГОСТом на методы определения соматических клеток, что приводит к завышению истинного значения. Тем не менее, рынку такая идея понравилась.

Для ООО НПП «Лабораторика», это было сигналом и указателем в каком направлении двигаться. Но при разработке своего варианта счётчика клеток мы пошли ещё дальше, значительно расширили его возможности:

• 1. Не только подсчёт клеток, но и обязательная их дифференциация по размеру и типу. Это позволяет подсчитать все клетки: от бактерий, размером 0,3 мКм до самых крупных макрофагов, размером 30 мКм.
• 2. Разделение дрожжевого мастита и субклинического, что важно для лечения животных. К примеру, если мы берём счётчик компании Делаваль и получаем результат 1,5 млн. колоний клеток – это повод начать медикаментозное лечение антибиотиками. Но что, если это дрожжевой мастит – ведь его нельзя лечить антибиотиками, он к ним невосприимчив и даже наоборот! Таким образом, диагноз может быть неточным: зря потратим деньги на лечение и потеряем стоимость молока на период вакцинации.

Все эти вопросы были учтены в счётчике соматических клеток «Эксперт ССК», после чего он получил вторую модификацию в виде анализатора «Эксперт Супер Плем Комбо».

Принцип работы таков: молоко, попадая в пробирку воздействует с лизогенным буфером, он, разрушает цитоплазматическую мембрану соматической клетки - при этом ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя. Краситель связывается с двуспиральной ДНК соматических клеток и образует флуоресцентное вещество, позволяющее идентифицировать клетки. Далее встроенный микроскоп увеличивает их изображение, встроенная ССД камера делает фотографии, а программное обеспечение подсчитывает их количество.

Однако, это не просто подсчёт, кол-ва клеток – в первую очередь определяется их размер в микронах, что, согласно действующего госта, нам позволяет отдельно подсчитать бактерии, нейтрофилы, лимфоциты, лейкоциты, эпительные клетки и дрожжи.

Хотя для определения сортности молока, кол-во соматических клеток подсчитывается в целом в диапазоне от 8 мКм до 20 мКм.

Несмотря на то, что ранее данный метод применялся только для коровьего сырого молока, мы смогли расширить возможности нашего анализатора, чтобы можно было работать с молоком сырым, пастеризованным и от разных животных. Таким образом – существенно расширили возможности анализатора за рамки ГОСТа!

В отличие от классического микроскопического метода подсчёта соматических клеток и шведского счётчика, в «Эксперт ССК» мы добились ряда преимуществ: высокая воспроизводимость результатов, в разы снижена себестоимость анализа и время измерения (от 15 до 60 секунд). Не требуется дополнительная квалификация для лаборанта: Вы используете набор расходных материалов, который идёт в комплекте и образцы молока для исследования. Всё.

Данный анализатор позволяет не только сосчитать количество соматических клеток и дифференцировать их, но и вести научную работу.

ВСЁ ВЫШЕСКАЗАННОЕ ЯВЛЯЕТСЯ УНИКАЛЬНЫМИ ПРЕИМУЩЕСТВАМИ АНАЛИЗАТОРА «ЭКСПЕРТ ССК», А УЧИТЫВАЯ, ЧТО СТОИМОСТЬ ОДНОГО ИЗМЕРЕНИЯ НА НЁМ НИЖЕ В 4,5 РАЗА, ЧЕМ У «DELAVAL DCC» – ДЕЛАЕТ ЕГО, ПОЖАЛУЙ, САМЫМ ОПТИМАЛЬНЫМ ИНСТРУМЕНТОМ НА РЫНКЕ ВСЕГО МИРА!

• она рассчитана не на одно, а на 4 измерения (сектора A, B, C и D)
• в режиме эталонного измерения (REF) задействованы все четыре сектора – получаем среднее значение с коэффициентом вариации, стремящимся к нулю!
• для каждого измерения мы разделили каждый сектор кюветы на 16 подсекторов – таким образом каждое измерение состоит из 16 усреднённых. Для примера, у “Шведов” – только одно, посередине кассеты (отсюда и высокая допустимая погрешность для их счётчика DCC).